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水通道蛋白-4

毕业论文

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水通道蛋白-4 与血脑屏障发育及其完整性的关系
郑跃英 祝胜美
浙江大学医学院附属第1医院麻醉科
水通道蛋白(Aquaporins,AQPs)是介导水跨膜转运的1大膜蛋
白家族,分布于高等脊椎动物上皮细胞或内皮细胞.结构上由28-KDa
亚单位组成4聚体,每个亚单位构成孔径约0.38nm的水孔通道,在
渗透压驱动下实现水双向跨膜转运【1】.目前11种亚型已经在哺乳动
物中被确定(AQP0-10),各种亚型的体内分布具有组织特异性,其
中水通道蛋白-4 (Aquaporin 4,AQP4)以极化形式集中分布于中枢神
经系统脑毛细血管周边的星形胶质细胞足突或室管膜细胞【2】.
血脑屏障(blood-brain barrier, BBB)为脑内另1调控水平衡
的复合体,由无窗孔的脑毛细血管内皮细胞及细胞间紧密连接,基底
膜,星形胶质细胞等组成,介于血液和中枢神经系统(central
nervous system,CNS)之间,限制血液中某些离子,大分子物质转移
到脑实质,此屏障作用为维持CNS内环境稳定,保障脑功能正常行使
提供了重要保障.BBB分化发育过程中脑毛细血管内皮细胞间紧密
连接的形成虽被认为是其成熟的标志,但BBB生理功能的实现有赖
于各组成成分间的相互作用.近来对星形胶质细胞调控BBB物质交
换和脑内水平衡方面的作用日益受到重视,并认为与AQP4表达有
关.
本文就AQP4与血脑屏障发育及其完整性关系的研究进展作1
中华麻醉在线 https://www.csaol.cn 2007年9月
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综述.
1.BBB分化发育过程中AQP4的表达
目前由于对鸡胚视顶盖中血管及BBB分化的研究已较完善,因
此常被用于BBB的研究模型.Nico及其同事【3】采用免疫细胞化学,
分子生物学技术研究了鸡胚视顶盖AQP4在BBB分化发育过程的动
态表达.免疫电镜显示鸡胚视顶盖发育第9 d,BBB仅由不规则的内
皮细胞组成,内皮细胞间紧密连接尚未形成,AQP4未见表达.待发
育至第14 d,Western blot 技术首次在约30 kDa链附近检测出AQP4
的免疫活性,电镜下显示短的内皮细胞间紧密连接已形成,并串联构
成BBB的微血管,星形胶质细胞间断黏附于血管壁,AQP4不连续
地表达于血管周边,血管周围仍然存在小空隙.发育第20 d BBB成
熟,内皮细胞间紧密连接形成,BBB微血管被星形胶质细胞紧紧包
被,血管周边星形胶质细胞足突上的AQP4呈现强阳性表达,且冷冻
断裂研究显示AQP4的正交排列阵也同步形成.而在啮齿类动物,
BBB分化发育发生于出生后,AQP4表达与BBB发育也表现出1定
的同步性.大鼠出生后脑毛细血管呈最大速率增殖,BBB逐步发育
完全,脑内AQP4的首次检出也恰在出生后(生后第7 d的小脑内),
且随BBB分化发育逐渐增加【4】.
以上证据显示不论BBB于胚胎期发育完全的禽类还是出生后发
育完全的啮齿类动物,AQP4表达与BBB分化发育都表现出1定意
义的同步性,说明脑内水调控与血脑屏障关系密切.
2.AQP4在BBB发育过程中的作用
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水通道蛋白的表达与BBB生理功能间的联系在胚脑发育过程中
得到了很好地体现.啮齿类动物胚脑发育之初,巨大的细胞外间隙
(ECS)容纳着大量水和离子,仅通过简单扩散将其转移入血液,ECS
容积改变不明显.随着BBB分化发育,胶质细胞在脑毛细血管外层被
膜形成,AQP4表达增多,待到脑发育后期BBB分化发育成熟时,ECS
内水及离子得以高效转运,ECS容积迅速减小,完成了脑的最后发育
【4】.
为进1步揭示AQP4在BBB发育过程中的作用,研究者【3】采用脂
多糖(LPS)破坏发育20 d的鸡胚视顶盖(即发育成熟的BBB)以模
拟脑膜脑炎时的病理病变.受LPS影响电镜下BBB形态发生明显改
变,内皮细胞间紧密连接被分开,血管周边星形胶质细胞足突明显水
肿,AQP4免疫反应活性变微弱且呈间断分布,表明BBB受损时AQP4
也发生相应改变,AQP4是脑水肿发生的关键因素,且BBB与调控水流
的AQP4关系密切.
3.mdx和mdx3cv模型中BBB结构和AQP4表达的变化
mdx模型模拟了人类Duchenne型肌营养不良症(DMD).此病
为X性连锁隐性遗传性肌病,由于编码抗肌萎缩蛋白(dystrophin)的
DMD基因缺陷(缺失或突变),肌细胞内缺乏dystrophin,导致肌纤
维膜细胞骨架功能缺失,产生对称性肌无力,肌萎缩为主要特征的临
床症状【5】.近年来该病的细胞膜学说得到多数学者的认同,即肌细
胞遗传性某种代谢缺陷使肌纤维膜结构和功能发生改变,因此细胞膜
尤其是膜蛋白的研究成为DMD膜假说的重要手段.研究显示mdx小鼠
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肌纤维膜上AQP4蛋白呈年龄相关性下调,1岁龄成年mdx小鼠较年龄
相仿的野生型小鼠AQP4表达下调90%以上【6】,脑内AQP4的表达也
呈现与年龄相关的下调,同时DMD患者的肌组织活检也显示AQP4表
达下调的结果【7】,因此目前认为AQP4表达的改变涉及DMD的发病,
mdx模型也因此被用于AQP4的研究.
Nico等【2】研究显示dystrophin 表达缺陷的18-20个月龄的mdx
小鼠BBB形态改变明显,内皮细胞间紧密连接断裂,细胞旁及细胞
间转运增加,血管周围星形胶质细胞水肿,AQP4表达下调,BBB渗
透性增加,血管源性水肿形成.进1步研究显示BBB改变始于mdx
小鼠出生前,即肌肉病理特征尚未表现时,表达于内皮细胞胞膜的细
胞间紧密连接相关蛋白ZO-1下调并移位至胞浆,影响细胞间紧密
连接的形成,GFAP(星形胶质细胞表面的1种标志物)下调,星形
胶质细胞减少,AQP4表达也下调,血管渗透性增加【8】.mdx模型说
明BBB完整性和星形胶质细胞调控水转运的作用密切相关,同时也
说明脑内AQP4的定位有赖于dystrophin蛋白.脑内dystrophin蛋白包
括DP140,DP71及长链dystrophin DP427,以DP71为主.由于mdx
模型并不影响DP71表达,遂采用敲除DP71的mdx3cv模型进1步研
究.mdx3cv模型中2月龄小鼠即出现AQP4表达下调,较mdx小鼠提
前出现.免疫组化显示mdx3cv小鼠脑皮质血管周围的大量星形胶质细
胞足突甚至没有AQP4染色,免疫金结果进1步明确显示肿胀的星形
胶质细胞足突出现极少的AQP4金颗粒,且少量AQP4金颗粒移位至
神经纤维周边的星形胶质细胞膜.AQP4在mdx3cv小鼠模型的表达改
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变也说明DP71对其在脑内的准确,稳定定位起关键作用.
4.AQP4与BBB完整性的关系
DMD,颅脑机械损伤,神经系统损伤,化脓性脑病,颅脑肿瘤,
永久性脑缺血或短暂性脑缺血再灌注损伤等病变多伴有BBB损伤,脑
血管渗透性增加及血管源性水肿,而AQP4在其中的上调或下调表达
不1【9,10,11,12】,以致难以明确AQP4上调或下调与水肿形成或消退的关
系.AQP4上调是引起水肿的早期原因抑或是水肿发生后促进水肿液
排出的反应,AQP4下调阻止了水肿液清除而致水肿抑或是AQP4下调
是抑制水肿恶化的机体防御反应
mdx,mdx3cv小鼠AQP4表达下调同时血管周边星形胶质细胞水
肿【13】,说明生理情况下AQP4下调可能促进水肿形成.水中毒情况下,
敲除AQP4基因模型及mdx模型较野生型动物更易抑制脑水肿形成
【13,14,15】,说明水中毒病理情况下AQP4下调可能抑制脑水肿形成.病
理和生理情况下渗透梯度的改变或许可以解释AQP4此截然相反的作
用.生理情况下,由于AQP4与内在整流性K+通道(Kir 4.1)共定位,
使脑实质内水及神经元放电活动释放出的K+被及时清除入血流,确保
神经信号的正常传导和脑内环境的渗透平衡【13,16】,因此认为生理情
况下水通过AQP4从脑实质流向血液,而AQP4缺乏或减少则阻碍水正
常清除导致脑水肿.相反,在脑水平衡失调的病理情况下,脑内水从
血流反向流入脑实质,AQP4上调则促进脑水肿形成,抑制其表达则
抑制水肿形成.
5. AQP4在星形胶质细胞-血管内皮细胞混合培养体系中的表达
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细胞培养是胶质细胞-内皮细胞间相互作用体外研究的良好工
具【17,18】.免疫荧光分析显示AQP4主要表达于星形胶质细胞离体培养
系中的质膜,不同于在体脑内星形胶质细胞足突上的极化分布,提示
BBB可能调控AQP4的分布【19】.大量研究已经证明星形胶质细胞和血
管内皮细胞间具有相互调控作用【20,21,22】,而多数研究仅针对星形胶质
细胞对内皮细胞的影响,为证实内皮细胞会影响星形胶质细胞单细胞
培养系中AQP4的分布,研究者将小鼠脑毛细血管内皮细胞bEnd3平置
于取自小鼠或大鼠的星形胶质细胞单细胞培养体系中,使两类细胞直
接接触以混合培养.和bEnd3内皮细胞共培养7-14d后,星形胶质细
胞和内皮细胞形态都发生明显改变.星形胶质细胞由扁平,单1的融
合层转变成由延伸的多细胞柱和肥厚的足突构成的岛屿状,内皮细胞
形成毛细血管样结构.而bEnd3内皮细胞单细胞系培养时并无上述改
变,证明内皮细胞和星形胶质细胞间的确存在信息交流.免疫荧光分
析技术进1步显示,与星形胶质细胞单细胞培养系相比,混合培养体
系中AQP4免疫染色增强,且极化分布于靠近内皮细胞,GFAP阳性的
星形胶质细胞足突,极少或没有表达于质膜或细胞内【23】,进1步从
体外形象地说明内皮细胞是影响了AQP4在星形胶质细胞足突极化表
达,同时从另1侧面说明AQP4表达与BBB发育相互关联.至于影响
AQP4在混合培养体系中再分布的具体分子机制目前仍处于研究中.
综上所述, AQP4表达变化与BBB分化发育过程具有同步性,两者
在调控脑内水平衡方面相互作用,相互影响.研究两者在调控脑内水
平衡方面的具体关关系将有助于脑水肿的研究,必将为寻找脑水肿的
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治疗手段开辟新途径.

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